تعداد صفحات: ۱۸۹ | قابل ویرایش
فهرست
عنوان……………………………………………. صفحه
الف- مقدمه………………………………………. ۱
ب-چکیده…………………………………………. ۳
فصل اول:کلیات …………………………………… ۵
۱- تاریخچه …………………………………… ۶
۲- خصوصیات کلی مایکوپلاسما…………………………. ۶
۳- مقاومت مایکوپلاسماها…………………………… ۸
۴- طبقه بندی مایکوپلاسماها………………………… ۹
۵- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس……………………… ۱۲
۶- فیلوژنی……………………………………… . ۱۴
۷- ساختمان ……………………………………. ۱۵
۱-۷-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس …………………… ۱۵
۲-۷- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم ………………. ۱۷
۸- بیولوژی مولکولی………………………………. ۱۹
۹- توالی‌های تکراری………………………………. ۲۳
۱۰- پروتئینهای سطحی……………………………… ۲۵
۱۱- فاکتور حدت………………………………….. ۳۰
۱۲- آنالیز پروتئین …………………………….. ۳۲
۱۳- طبقه بندی سویه‌ها ……………………………. ۳۴
۱۴- مشخصات گونه مایکوئیدس………………………… ۳۵
۱۵- کشت و رشد گونه مایکوئیدس …………………….. ۳۸
۱۶- کشت و رشد گونه کاپری کولوم …………………… ۴۱
۱-۱۶- محیط Thiacourt …………………………….. ۴۱
۱۷- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان……………….. ۴۴
۱-۱۷- علائم بالینی ………………………………. ۴۵
۲-۱۷- علائم کالبدگشایی بیماری …………………….. ۴۷
۳-۱۷- پاتوژنز ………………………………….. ۵۰
۱-۳-۱۷- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی………….. ۵۳
۴-۱۷- اختصاصیت میزبان……………………………. ۵۷
۵-۱۷- انتقال بیماری ……………………………. ۵۸
۶-۱۷- سیر همه گیری ………………………………. ۵۹
عنوان………………………………………… … صفحه
۱-۶-۱۷- مخزن……………………………………. ۵۹
۲-۶-۱۷- راه انتقال………………………………. ۵۹
۷-۱۷- پیشگیری و کنترل……………………………. ۶۰
۱-۷-۱۷- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری…. ۶۱
۲-۷-۱۷- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری……………… ۶۲
۳-۷-۱۷- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی……………. ۶۳
۱۸- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان ……………….. ۶۳
۱-۱۸- علائم بالینی ………………………………. ۶۴
۲-۱۸- علائم کالبد گشایی…………………………… ۶۶
۱۹- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم………….. ۶۹
۱-۱۹- سندروم MASKePs…………………………….. 70
۲-۱۹- علائم بالینی……………………………….. ۷۱
۳-۱۹- علائم کالبد گشایی…………………………… ۷۱
۴-۱۹- سندروم آگالاکتیه واگیر………………………. ۷۳
۲۰- گونه مایکوپلاسما کاپری ……………………….. ۷۳
۱-۲۰- بیماریزایی ……………………………….. ۷۳
۲-۲۰- علائم کالبد گشایی…………………………… ۷۴
۲۱- سیر همه‌گیری………………………………… ۷۵
۱-۲۱-مخزن……………………………………… .. ۷۵
۲-۲۱-راه انتقال………………………………… ۷۶
۳-۲۱-جمعیت میزبان………………………………. ۷۷
۲۲-پیشگیری وکنترل ……………………………… ۷۷
۱-۲۲- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری…. ۷۷
۲-۲۲- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری………………. ۷۸
۳-۲۲- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی…………….. ۷۸
۲۳-واکسن…………………………………………. ۷۹
۱-۲۳-واکسن MmmLC …………………………….. ۷۹
۲-۲۳-واکسن Mccp ……………………………….. ۷۹
۳-۲۳-واکسن Mcc ……………………………….. ۷۹ ۷۹
اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس ……………… ۸۰
عنوان………………………………………… … صفحه
۲۵-تشخیص افتراقی……………………………….. ۸۰
۱-۲۵-شناسایی عامل بیماری زا …………………….. .. ۸۱
۱-۱-۲۵-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی ۸۱
۲-۲۵- تشخیص آزمایشگاهی …………………………. ۸۱
۱-۲-۲۵- روش کشت و جداسازی……………………….. ۸۱
۱-۱-۲-۲۵- انتخاب نمونه ها …………………………. ۸۲
۲-۱-۲-۲۵- آماده سازی نمونه ها …………………… ۸۲
۳-۲۵- تستهای بیوشیمی……………………………. ۸۳
۴-۲۵- روشهای سرولوژی……………………………. ۸۵
۱-۴-۲۵- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی ……………… ۸۵
۲-۴-۲۵- تست مهاری رشد ……………………………. ۸۷
۳-۴-۲۵- تست ایمونو فلورسانس ……………………….. ۸۸
۴-۴-۲۵- تست رسوب ژلی………………………………. ۸۸
۵-۴-۲۵- تست فیکساسیون کامپلمان …………………….. ۸۹
۶-۴-۲۵- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون ……………….. ۸۹
۷-۴-۲۵- تست آگلوتیناسیون لاتکس……………………. ۹۰
۸-۴-۲۵- تست الیزای رقابتی……………………….. ۹۱
۹-۴-۲۵- سایر تستهای تشخیصی………………………. ۹۴
۵-۲۵ – مشکلات روشهای سنتی………………………… ۹۴
۶-۲۵- تشخیص با استفاده از PCR…………………… 95
فصل دوم: روش کار
۲۶- روش کار …………………………………… ۱۰۱
۱-۲۶- جمع آوری نمونه ……………………………… ۱۰۱
۱-۱-۲۶- مواد لازم………………………………….. ۱۰۱
۲-۱-۲۶- بخش جمع آوری نمونه………………………. ۱۰۱
۳-۱-۲۶- نمونه برداری …………………………… ۱۰۳
۲-۲۶- کشت و جداسازی نمونه ها…………………….. ۱۰۴
۱-۲-۲۶- مواد لازم ………………………………. ۱۰۴
عنوان………………………………………… … صفحه
۲-۲-۲۶- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان …………………………………………. ۱۰۶
۱-۲-۲-۲۶- مواد لازم …………………………….. ۱۰۶
۲-۲-۲-۲۶- روش تهیه محیط کشت………………………… ۱۰۷
۳-۲۶- استخراج DNA مایکوپلاسما……………………. ۱۰۹
۱-۳-۲۶- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی…………. ۱۰۹
۴-۲۶- فرایند PCR ……………………………… 110
۱-۴-۲۶- مواد لازم ………………………………. ۱۱۰
۲-۴-۲۶- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR ……………… 112
۱-۲-۴-۲۶- افزوده سازی DNA نمونه‌ها ………………. ۱۱۲
۲-۲-۴-۲۶- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده……….. ۱۱۵
۳-۲-۴-۲۶- تهیه مخلوط اصلی اولیه………………….. ۱۱۵
۳-۴-۲۶- پرایمرها……………………………….. ۱۱۵
۴-۲۶- واکنش PCR……………………………….. 117
۵-۲۶- تهیه ژل الکتروفورز ……………………….. ۱۱۸
۱-۵-۲۶- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید ………………. ۱۱۹
۶-۲۶- الکتروفورز …………………………………. ۱۲۱
۷-۲۶- رویت باندهای ایجاد شده ……………………. ۱۲۲
فصل سوم: نتایج
۲۷- نتایج …………………………………….. .. ۱۲۴
۱-۲۷- جداسازی………………………………….. ۱۲۴
۱-۱-۲۷- بررسی عملکرد محیط کشت……………………. ۱۲۴
۲-۱-۲۷- نتایج کشت نمونه های ارسالی ………………. ۱۲۴
۱-۲-۱-۲۷- نتایج روز پنجم ………………………. ۱۲۵
۲-۲-۱-۲۷- نتایج روزهفتم تا دهم…………………… ۱۲۵
۳-۲-۱-۲۷- نتایج روزپانزدهم………………………. ۱۲۶
۲-۲۷- نتایج PCR ……………………………….. ۱۲۶
۱-۲-۲۷- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر جنس ……….. ۱۲۶
۲-۲-۲۷- تائید کلونی های جدا شده………………….. ۱۲۷
۳-۲-۲۷- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس ۱۲۷
۴-۲-۲۷- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه.. ۱۲۸
۵-۲-۲۷- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ ۱۲۹
۳-۲۷- نتایج کالبد گشایی…………………………. ۱۳۰
۱-۳-۲۷- معیار انتخاب …………………………… ۱۳۰
عنوان………………………………………… … صفحه
فصل چهارم: بررسی نتایج
نمودارها…………………………………………. ۱۳۱
فصل پنجم: بحث
۲۸- بحث …………………………………………. ۱۳۹
۱-۲۸- ضایعات کالبد گشایی…………………………… ۱۳۹
۲-۲۸- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما ………….. ۱۴۱
۳-۲۸- روش کشت………………………………….. ۱۴۲
۴-۲۸- روش PCR ……………………………….. ۱۴۷
۵-۲۸- فراوانی گونه ها ………………………….. ۱۵۲
۲۹- خلاصه انگلیسی……………………………….. ۱۵۹
۳۰- منابع …………………………………….. .. ۱۶۰
چکیده
کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس در برگیرنده مهمترین پاتوژنهای تنفسی نشخوارکنندگان است که سالیانه، خسارات اقتصادی سنگینی بر صنعت دامپروری کشورهای جهان وارد می‌کند. اخیرا شیوعهای بازپدیدی از عفونتهای پلوروپنومونی نشخوارکنندگان در منطقه خاورمیانه گزارش شده است.
در این شرایط تعیین وضعیت گله‌های کشور از نظر آلودگی به گونه‌های پاتوژن این کلاستر، از اهمیت خاصی برخوردار است. هنوز گزارشی از شناسایی و جداسازی گونه‌های درگیر از عفونت پلوروپنومونی در ایران بدست نیامده است. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک در نمونه‌های بالینی و دشواریهای فراوان جداسازی میکروارگانیسم، به ضرورت شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی جایگزین افزوده است.
علاوه بر این، دستیابی به روشی کاربردی و سریع، در تشخیص عفونتهای تنفسی گله‌ها و تخمینی از وضعیت عفونت در ایران، مدنظر این تحقیق بوده است.
در این مطالعه، ۱۰۰ نمونه ریه با ضایعات مشکوک به عفونتهای تنفسی مایکوپلاسمایی از ۱۰۰ گله مشکوک (۵۰ گله گاو،۳۰ گله گوسفند،۲۰ گله بز) در اطراف کرمانشاه ، در سالهای ۱۳۸۶-۱۳۸۴ جمع آوری شدند. ضایعات ماکروسکوپی شامل کبدی شدن ریه‌ها با زخم‌های خاکستری و سفید(جامد شدن) و ظاهر منقوط با یا بدون فیبرین بودند. نمونه‌ها در محیط کشت PPLO براث و آگار کشت داده شدند. پس از پاساژهای متعدد،از ۲۳ گله مشکوک،تک کلونی تخم‌مرغی شکل مایکوپلاسما جداشد(۱۱ گله گاو،۸ گله گوسفند،۴ گله بز).
مقدمه
عفونت پلوروپنومونی واگیر، بیماری تحلیل برنده تنفسی است که با جای گرفتن در طبقه‌بندی بیماریهای سازمان جهانی کنترل بیماریهای واگیر، لزوم و اهمیت شناسایی آن مشخص شده است. عامل اصلی این بیماری، گونه مایکوپلاسما مایکوئیدس می‌باشد که تایپ کلونی کوچک آن بطور اختصاصی به گله‌های گاو، خسارات فراوانی ناشی از همه‌گیری گسترده و مرگ و میر فراوان تحمیل کرده است.
تایپ کلونی بزرگ این گونه همراه با دو گونه دیگر بنامهای مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری کولوم و مایکوپلاسما مایکوئیدس کاپری فرم غیرکلاسیک پلوروپنومونی واگیر را در گله‌های گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. این بیماری در فرم کلاسیک، که عامل آن مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری پنومونی شناخته می‌شود، خسارات اقتصادی سهمگینی در گله‌های بز و گوسفند موجب گردیده است.
از آنجائیکه منطقه خاورمیانه جزو مناطق مشکوک به آلودگی پلوروپنومونی واگیر محسوب می‌شود، حفظ وضعیت عاری بودن از عفونت در این منطقه، مشکل یا تقریبا غیرممکن بوده و نیازمند بازنگری درراهبردهای بکار رفته به منظور تشخیص و کنترل این عفونت‌هاست.
عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک تشخیصی و پاتولوژیکی، مسیر بیماریزایی ناشناخته و تنوع فنوتیپی بسیار پیچیده ارگانیسم در مواجهه با دستگاه ایمنی میزبان، بر مشکل شناسایی آن افزوده است. علاوه بر این ، ابقا طولانی مدت باکتری در محل عفونت و وجود ناقلین بدون علامت، برنامه کنترل بیماری را با چالش روبرو کرده است.
از این رو، شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی و تفریقی گونه‌های کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس که هرکدام استراتژی جداگانه ای در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.
تاریخچه
عامل اصلی بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان ـ که امروزه به نام مایکوپلاسما مایکوئیدس مایکوئیدس بیوتایپ کلونی کوچک شناخته می‌شود- در سال ١٨٩٨ برای اولین بار توسط نوکارد وروکس شناسایی گردید. در آن زمان، اولین نام نهاده شده بر این اجرام، پلوروپنومونی بود که بعد از این که اجرامی با خصوصیت مشابه این میکروارگانیسم از منابع دیگر به دست آمد، بنام اجرام شبه پلوروپنومونی نام‌گذاری شد. ۶٠ سال بعد، نواک نام مایکوپلاسما را به عنوان نام ژنریک اجرامی که فاقد دیواره سلولیاند، پیشنهاد کرد.
خصوصیات کلی مایکوپلاسما
مایکوپلاسماها، جزو کوچک‌ترین پروکاریوت‌هایند (μm١۵-٠) که قادرند از فیلترهای مخصوص باکتری (μm۴۵-٢٢/٠) عبور کنند. این اجرام به دلیل فقدان دیواره سلولی، اشکال پلی‌مورفیک دارند و به اشکال کروی (μm٣/٠-٩/٠)، رشته‌ای (تا μm١)،گلابی شکل، شاخه‌ای و مارپیچی در زیر میکروسکوپ الکترونی دیده می‌شوند.
در واقع، بیشتر شبیه به فرم L باکتری‌ها می باشند.ارگانیسم از سه ارگانل شامل غشا سلولی، ریبوزوم و مولکول حلقوی DNA تشکیل شده است. تصویر مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ الکترونی، شبیه فیلامان (بطری) است که از دو انتها طویل شده است. این اندامک‌‌های انتهایی، محل اتصال به غشا یوکاریوت است که دارای یک ساختمان مرکزی میله مانند می‌باشد و توسط غشا احاطه شده است.
مجموعه خصوصیاتی مانند عبور از صافی‌های مخصوص پالایش باکتری، عدم حساسیت به آنتی‌بیوتیک‌ها و دشواریهای رشد، آنها را شبیه به ویروس‌ها کرده است. ولی وجود محتوای ژنتیکی DNA (٧-۵/١)% و RNA (١٧-٨)% که توسط غشای پلاسمایی سه لایه‌ای حفاظت شده است، سبب تمایز آنها از ویروس‌ها، کلامیدیا وریکتزیاها می‌شود. به دلیل دارا بودن حداقل ژن‌های لازم برای تکثیر مستقل- که در حدود تا محتوای ژنتیکی E.coli است ـ نیازمند موجودات زنده برای تکثیر و زنده‌مانی نمی‌باشند.
